KEGG通路是在功能分析中非常有效的富集方法，通过富集分析，我们可以有效识别出和目的基因（interest gene）显著相关的生物学功能。常用的富集手段有超几何分布，fisher精确检验，二项分布等等。例如DAVID软件就是采用校正的Fisher exact test算法。然而这种通路富集分析的方法存在一定的局限性，那就是获得的结果只能是一条完整的大通路，如代谢通路或其他调控通路，但是通过观察，我们发现在每条通路中仍可进一步分为多个小的通路，并参与调控某些特定的功能，我们称之为——子通路。
分析流程
1、导入数据导入数据为基因列表形式，即由用户提供需要进行富集的基因列表，基因为gene symbol形式，格式如图所有的通路XML格式分析文件已从KEGG通路数据库下载，作为底层分析数据进行调用。命令行操作界面如下用户输入包含基因列表的文件名，筛选显著子通路的阈值，以及计算显著性的算法。
2、 ID转换由于KEGG数据库使用的是自己的ID，通路中包括多种元素，如‘hsa’开头的代表蛋白质，‘cpd’开头的代表化合物等等。在通路XML格式文件中，所有的通路元素都被标记为KEGG的ID，如下所示第一列数字代表元素ID，第二列为对应的基因或化合物信息，有些ID可能对应多个基因。在富集过程中我们主要关注的是蛋白和基因，所以在拆分子通路的过程中，我们过滤掉化合物等非基因元素，最后将所有的元素ID转换成gene symbol。所有的通路内基因编号，ID，symbol等信息均来自KEGG数据库主页下载获得。
3、 拆分子通路拆分过程包括以下两部分：第一步，我们通过正则表达式，从XML通路文件中提取所有的基因互作对，即对应着通路中通过边连接的两个基因，他们之间的舍膺雕沆边可能代表激活，抑制，磷酸化等，这些具体的互作类型不在我们考虑范围内，我们只想知道两个基因是否有互作关系。并且最重要的一点，从XML文件获取的互作对信息是有向互作，即它们之间的边代表了方向性，这保证了我们在后面从根节点向叶子节点grow的过程可以有向的进行。第二步，收集所有存在互作的非孤立基因，获得通路内的基因列表，对每一个基因进行迭代过程。在每一次迭代中，我们都假设这个基因为根节点，将所有与之互作的基因作为他的叶子节点，以此类推，直到获得最末端的叶子，迭代终止。这样我们就获得了一条子通路。
4、 合并子通路在拆分子通路过程中，由于每个基因节点都被作为根节点进行了一次迭代过程，所以会出现一种情况，那就是一条子通路的根节点很可能是另一条子通路的叶子节点，两条子通路具有重复性。举例来说就是一条子通路是从树干到叶子，而另一条子通路是这条树干上的一条树枝。用图来说明就是下面的情况如图，在由ABC构成的通路中，我们可以拆分得到下面三个子通路，分别是ABC, AC, BC。但是BC这条子通路其实是ABC的一部分，所以我们要将这样的子通路进行合并，最后我们期望得到的结果是1. ABC 2. AC。
5、显著性计算我们从一条KEGG通路中获得了X条子通路，但是并不是每一条子通路都和我们的interest gen髫潋啜缅e显著相关，有些子通路中甚至不包含任何interest gene。为了识别出被interest gene显著富集到的重要子通路，这里我们采用超几何分布的算法。对于一个KEGG通路，我们计算通路中完整基因作为背景数据，对于M个interest gene，我们计算在一条由N个基因构成的子通路中，至少有K个基因属于interest gene的概率。输出结果如下用户可根据右侧显著性P值筛选重要的子通路，若interest gene显著富集到某一大通路，则这些显著的子通路则提示了interest gene具体的生物活动和作用机制。
6、 FDR校正所有经过超几何分布或Fisher精确检验计算的子通路显著性P值均经过BH多重检验法进行校正，校正前和校正后的P值信息均保存在结果文件‘pathID_subpath_sig.txt’文件。由于对所有KEGG通路进行拆分和子通路显著性富集后由于获得数据和文件较多，所以这里增加了一个显著性阈值的筛选，例如用户在命令行设定阈值0.05，则只输出显著的主通路和子通路信息。输出文件以每个主通路命名，包括每条子通路信息，富集到子通路内的基因个数，基因列表，显著性P值，FDR值，格式如下完整代码下载地址http://pan.baidu.com/s/1bncwRUJ
