1、先下载好primer premier5.0软件，按注册机提示激活该软件，然后双击打开该软件。如下图示
2、然后进入NCBI数据库里面选择自己需要设计引物的基因，然后查找到该基因的DNA序列。一般以搜索Nucleotide可以得到包含该基因序列的详细信息，图中以基因LOC100159271为例。
3、点击上图中页面靠右上角“send”旁边的倒三角形下拉符号，在下拉框下面圆点选择“Coding Sequences”，Format下面选择“FASTA Nucleotide”,最后点击“Create File”,可以得到TXT的序列文档的下载提示框。
4、在下载提示框里点击下载，将得到的序列TXT文档下载下来，然后打开该文档，选择文档中的基因序列部分，复制。如下图示。
5、然后回到primer premier5.0 打开界面，点击左上角的“file”,选择下拉框中的“new”,再点击横框中的“DNA Sequence”,则会弹出新的对话框。如下图示
6、在上述界面中，导入你复制的序列，即在下面红箭头所指的地方Ctrl + V（粘贴） 你刚才复制的序列，在新的对话框内按“OK”选项，这样TXT文档中的序列就被导入到软件中了。
7、点击下图1中左上角中的“primer”，弹出新界面如下面图2所示，点击图2中的偏左上角中的“Search”,则会弹出新界面。
8、如下图示新界面，在新界面设置你需要设计的引物的相关参数。主要有五个要设置的地方，如下图红箭头标示。第一个地方是选择设计PCR引物，测序引物和杂交探针，如果要做PCR就选第一个圈圈“设计PCR引物”。第二个地方是搜寻模式，一般我们搜索引物是以对搜，所以一般选"pairs"。第三个地方是正负链的所在区间以及产物的大小长度，这个按自己的需要来，跟实验目的有关，具体情况具体分析。第四个地方是引物的长度以及正负波动值，一般来说引物长度在18——27范围内。第五个地方是选择模式，一般选“auto”。设置完上面所说的这些地方后按“OK”键，则跳转到新界面。
9、在新界面中点击“OK”（如下图示），会出现新界面。
10、在新界面中，右边表示引物的相关评分等信息，左边是该引物结合所在区间位置。
11、一般来说，选择右边评分最高的引物，点击使其成绿色，然后点击左上角对话框中的“File”下面的“print”横框中点击"Current Pair", 这样就能将所获得的设计的引物序列以及其详细信息导出来了。
