1、冰冻切片的制备 一、准备冰冻组织 1. 用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇(异戊醇)，然后不时放入蟛杆戛攉小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。 2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。 3. 收集组织标本。快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。 4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌满模具，直至标本完全被其覆盖。组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。酌情调整组织标本的位置。用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇(异戊醇)溶液中。为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。 （1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。不要用溶液清洗标本。 （2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。 5. 将冻好的组织标本保存在-80ºC 冰箱以待使用。
2、制作冰冻切片 1. 切片前先将冰冻组织标本从-80ºC冰箱里取出，放在冰冻切片机(-20ºC) 内复温。 2. 用O.C.T.将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上。调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片。直至切到预想的部位后，开始收集切片。根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度。3-6 µm是常用的切片厚度，也可以是25-50 µm厚。 3.切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定。如果选用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在经过20 分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者将其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。 4. 余下的冰冻组织块，可用O.C.T.覆盖其暴露面，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。