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酵母蛋白质和RNA的制备(稀碱法)

时间:2024-10-28 17:59:36

1、 酵母核蛋白的提取称取鲜酵母 30g 或干酵母粉 5g, 倒入 100ml 的烧杯中。加入 40ml 0.2%NaOH 溶液,在 20-40℃水浴上搅拌提取 泌驾台佐30-60min 后 4000r/min 下离心 10min, 取上清液于 50ml 的烧杯中,并置于放有冰块的 250ml 烧杯中冷却,待冷至 10℃以下时,用 6mol/L HCl 小心地调节溶液的 pH 至 3.0 左右。随着 pH 下降,溶液中白色沉淀逐渐增加,到等电点时沉淀最多(注意严格控制 pH )。 pH 调好后继续于冰水中静置 l0min ,使沉淀充分,颗粒变大。将此悬浮液以 3000r/min 离心 20min ,倒掉上层清液。将沉淀物转入蒸发皿内,放入真空干燥器或干燥箱中干燥之后称重,这就是酵母核蛋白粗品。2. 苯酚法提取酵母 RNA 取上述核蛋白研碎,加 10ml SDS-缓冲液使成匀浆,洗入各 Rppendorf 管(略少于管容积的一半),室温静置 10min ,再加等体积的饱和酚液,室温下剧烈振荡 5min 后置冰浴中分层, 4000r/min 离心 10min ,吸出上层清液,转入新的 Eppendorf 管,加 2 倍体积 95%乙醇(含2%乙酸钾),在冰浴中放置 30min ,使 RNA 沉淀。再以 10 000r/min 离心 5min ,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,迅速离心各 lmin ,保留沉淀。倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。3. 结果处理1) 计算核蛋白提取率2) RNA 含量测定将干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 10~50 μg/ml 的溶液,在 751 型分光光度计上测定 260nm 处的吸光度,按下式计算 RNA 含量:式中, A260 为 260nm 处的吸光度; L为比色杯光径(cm); 0.024 为 1ml 溶液含 1ugRNA 的吸光度。3) 计算 RNA 提取率

酵母蛋白质和RNA的制备(稀碱法)
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