1、获取引物模板引物与模板一一对应，设计引物之前先要俣挫呲蹀找到一段匹配的模板。以H9禽流感病毒HA基因为例，在NCBI上下载一个最新的病阢耔礞筠毒HA基因作为本经验所介绍的引物设计的模板。关于如何在NCBI上下载基因请参考小编的另一篇百度经验“怎样使用NCBI搜索并下载基因序列”。
2、新建打开Primer5（小编的版本为英文版），依次点击“file”——“new”——“DNA Sequence”，新建操作界面。
3、输入模板基因复制基因模板后，使用键盘快捷键“Ctrl+V”将下载的引物模板粘贴到空白框内，然后选择“As is”，点击“OK”。
4、Search Primer找到界面左上角“Function”——“Primer”，在新跳出的界面上点击“Search”，需要设置相应的条件，才能开始搜索。
5、条件设置点击“Search”后，又跳出一个界面，我们从上到下依次设置：“Search For”选择“PCR Primers”；“Search Type”选择“Pairs”；“Search Ranges”要根据不同的情况而定，一般来说选择基因全长，如“1”——“1683”；“PCR Product Size”一般鉴定选择300-500，测序选择1200-1600，不能超过基因全长；“Primer Length”一般为20+(-)2。
6、点击两次“OK”条件设置完毕后，点击“OK”，跳出新的界面后再点击“OK”，最后跳出软件为你选择的按照合成率从高到底的全部引物序列。
7、引物选择将引淦甓特猩物表与左侧表格结合起来进行引物的选择。从小编设计的引物表中看到，最高合成率为88，其对应的左侧表中均出现“Dimer”和“Cross Dimer”，说明此引物不甚理想。最佳的情况为“Hairpin”、“Dimer”、“False Priming”和“Cross Dimer”都不出现，也就是100合成率。
8、重新设置条件如何引物不甚理想，那么就需要重新设置引物的各个条件，尤其是“Search Ranges”的选择，需要我们再次点击“Search ”，跳出条件设置界面后重新设置。
9、选择理想引物经过多次的不断更改和设置后，最终选出较为理想的一对引物，合成率最好在98以上，四种状况均不出现为好。
