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PCR扩增检测转化植株的方法

时间:2024-10-18 06:13:18

1、首先,浸染液的制备,在转化前一天将农杆菌接种于加利福平(30 mg/L)、卡那霉素(70 mg/L)和四环素(6.5mg/L)的LB液体培养基中,28C 下,以2 00 r/min的转速,振荡培养过夜,至对数生长期。4C,以6000 r/min 的转速离心10min,收集菌体,用5 %的蔗糖溶液( 含0.05% Silwet L.77) 重新悬浮,至A=0.6~0.8,用作浸染液。

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2、然后,浸染拟南芥花序,将拟南芥倒扣于盛有浸染液的容器上方,使整个花序浸泡于浸染液中用109.6(m/V)蔗糖作对照,轻轻摇晃约10 min。将经过浸泡处理的植株用塑料薄膜罩盖保湿,连同培养容器横放,温室避光培养过夜。

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3、然后,在次日,移去透明塑料罩,将拟南芥植株直立放置,将水浇透。置于光照处22~25C条件下使其正常生长。

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4、然后,经2~~3 周养护,拟南芥开始开花结果。当第一个果荚成熟变黄时,用纸袋套住,当纸袋内的所有果荚变黄后,停止浇水,1~2 周干燥后收获种子,干燥条件下保存,准备转化种子筛选。

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5、然后,将收获的转基因拟南芥种子进行常规消毒: 在超净工作台中置于70%(V/V)乙醇中1min,1%NaCIO溶液中15 min,无菌水洗5~6 次,每次2 min。消毒好的种子撒播在含卡那霉素50mg/L的MS培养基中,置于22~25C光照培养箱中,进行初步筛选,能正常萌发的抗性植株有可能是转化植株。

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6、最后,转化植株的鉴定,鉴定农杆菌转化植株的方法很多,由于PBI 121上带有GUS 基因,可以利用GUS染色的方法鉴定,也可采用PCR法。由于PCR扩增检测操作简便、可靠,该法首先提取抗性植株的基因组DNA,根据目的基因设计的引物进行PCR扩增,扩增出目的带的即为转化子。

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